代谢工程在芳香族化合物微生物降解研究中的应用

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　　工业技术的迅猛发展，给人类社会带来了高度的物质文明，但也带来了许多负面效应，尤其是对人类生存环境造成的危害。芳香族化合物是一类广泛存在于自然环境中的化学物质，性质稳定，具有很大的毒性和致癌、致突变作用，而且一般都有较好的脂溶性，可以在人体和动物的脂肪组织内积蓄，从而造成长期的危害。人工合成的芳香族化合物在利用时不可避免的泄漏到环境中造成严重的环境污染，尽管人们已经认识到了问题的严重性，这一问题仍呈上升的趋势^[1]。

　　微生物降解环境污染物由于投资少、占地小又不需特殊设备而成为最有前途的治理环境污染的方法。但微生物细胞在代谢繁殖过程中，经济合理地利用和合成自身所需的各种物质和能量，这种固有的代谢网络相对实际应用而言其遗传特性并非最佳,所以有必要对细胞的代谢途径进行有目的的改造。

　　1  代谢工程

　　代谢工程的基本理论和应用就是在这一背景下发展起来的。1991年Bailey^[2]在“Science”上发表了一篇重要的综述文章“Toward a Science of Metabolic Engineering”，标志着代谢工程作为一门新学科的诞生。十多年来，代谢工程的理论和应用迅速发展。1995年Bailey^[3]又发表了“Chemical Engineering of Cellular Processes”的长篇文章，详细讨论了生物网络工程及代谢工程。1996年召开了第一次国际代谢工程会议(ME-I)。此后，国际代谢工程会议定期两年举行一次。1998 年出版了国际上第一部代谢工程教科书：“Metabolic Engineering : Principles and Methodologies”^[4]。1999年出版了“Metabolic Engineering”^[5]专著。近几年的主要研究进展可参见“Current Opinion in Biotechnology”等综述性刊物及其他一些刊物上的综述文章，例如：用代谢工程改进染料生产及使用^[6]；乳酸菌的代谢工程^[7,8]；工业微生物过程的代谢途径工程—进化、组合生物合成及合理设计^[9]；利用基因组学进行反向代谢工程^[10]；代谢通量分析进展^[11]。十多年的实践表明：代谢工程已经成为化学反应工程的一个新的前沿，代谢工程的应用范围及作用正在不断扩大，已经成为菌种改进的平台技术。我国的代谢工程研究也已展开，国家基金委及科技部资助的一些代谢工程研究项目或部分涉及代谢工程内容的项目正在进行。但总的说来，无论是政府及企业的投入、还是研究队伍及研究水平等方面看，我国代谢工程的总体研究水平及应用均与国际先进水平有较大差距。

　　代谢工程是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络、并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。其核心内容是对细胞代谢网络进行功利性修饰，以更好地利用细胞代谢进行化学转化、能量转导和超分子组装，完成这一过程首先要对细胞的分解代谢和合成代谢中的多步级联反应进行合理设计，然后利用DNA重组技术强化和(或)灭活控制代谢途径的相关基因^[12]。代谢工程把细胞的生化反应看作一个整体，假定细胞内的物质、能量处于一拟稳态，通过测定胞外物质浓度根据物料平衡计算细胞内的代谢流，并针对细胞内外环境的不稳定性，揭示细胞代谢的动态变化规律。在此基础上，构建新的代谢途径，将具有特定目的的工程菌应用于实际操作。

　　2  代谢工程在芳香族化合物生物降解中的应用

　　利用代谢工程，改变微生物细胞原有的代谢途径，提高其降解污染物的能力，对于控制和治理芳香族化合物的污染具有重要的意义。本文综述代谢工程在几类芳香族化合物生物降解中的应用。

　　2.1  苯及烷基取代苯的降解

　　苯的降解主要是由苯双加氧酶攻击苯环，形成邻苯二酚，邻苯二酚进一步通过间位或邻位双加氧酶的作用而产生粘康酸半醛或粘康酸，之后被进一步降解。对于烷基取代苯，取代基团的存在使苯环的降解出现两种可能：先攻击苯环或先攻击侧链。如果侧链很长，微生物就不会降解苯环，因为侧链的氧化已经足够提供生长的能量；而对于侧链较短的烷基取代苯，一般是通过加氧酶的作用，在2，3碳位上形成二酚，再由2，3-双加氧酶或1，2-双加氧酶将其开环裂解。其中，以甲苯降解酶系统的研究较多。降解途径如图1所示。

　　图1  甲苯的降解途径

　　甲苯降解酶的基因位于质粒pWW0上，可利用不同类型的芳烃如甲苯、二甲苯作为唯一碳源和能源。质粒上的代谢基因组成两个操纵子，xylCBA编码降解甲苯和二甲苯为苯甲酸和羟基苯甲酸的酶的基因，xylDLEGFJKIH编码由苯甲酸和羟基苯甲酸到乙醛和丙酮酸的降解酶的基因。尽管甲苯的途径具有很广泛的底物范围，但它却不能利用苯作为底物，这限制了对石油污染物的降解。已有研究表明，克隆编码甲苯还原酶的基因todC1C2BA，并将重组质粒导入P.putida mt-2中，则可彻底降解苯、甲苯和二甲苯^[13]。

　　因此，此类物质的降解，主要是经由加氧酶的作用，使得苯环的2，3位羟化，形成不稳定的邻苯二酚类物质，然后开环降解。其中加氧酶起很重要的作用。在甲苯降解过程模拟的基础上对代谢流进行分析，增加甲苯双加氧酶的活力可以使稳态流从0.074增加到0.091。所以，增加甲苯双加氧酶编码基因的拷贝数，可以提高降解菌的降解能力；如果将甲苯双加氧酶编码基因和基因todC1C2BA同时引入上述的P.putida mt-2中，其降解能力也会增强。

　　2.2  酚类的降解

　　苯酚是一种常见的酚类物质。苯酚的好氧降解是将苯酚分解为邻苯二酚，邻苯二酚由邻位和间位途径经环裂解，最后形成三羧酸循环中间物。厌氧代谢的第一步是将苯酚羧化为4-羟基苯甲酸。苯酚的降解基因通常成簇排列，位于大质粒上或染色体上。在好氧菌中，苯酚羟化酶基因是降解苯酚的关键基因，编码苯酚降解途径的第一个酶，将苯酚转化为邻苯二酚；邻苯二酚2，3-双加氧酶(C23 O，间位裂解)，或1，2-双加氧酶(CatA,邻位裂解)将邻苯二酚开环裂解为三羧酸产物^[14，15]。如图2所示。

　　图2  苯酚的降解途径

　　注：CatA为1，2-双加氧酶；C23 O为2，3-双加氧酶。

　　Giovanni等^[16]研究了Candida aquaetextoris酵母对4-壬基苯酚（pNP）的生物降解，结果显示，主要的代谢物为对羟基苯乙烯酸和4-乙酰苯酚。进一步的研究认为，对羟基苯乙烯酸可以被继续降解，但4-乙酰苯酚则会积累。通过分析4-乙酰苯酚的分子结构，可以发现它是苯酚的对位衍生物，如果在Candida aquaetextoris酵母中引入苯酚羟化酶基因，使得C.aquaetextoris酵母也可产生苯酚羟化酶，则4-乙酰苯酚也有可能被进一步降解；另外，4-壬基苯酚（pNP）也是苯酚的衍生物，苯酚羟化酶基因的引入，也可能使得pNP第一步就发生羟化，再经由开环而被降解。可以认为，对于其他的苯酚衍生物，如果邻位没有被取代，都可以先由苯酚羟化酶羟化，然后再被降解。

　　2.3  氯代芳香族化合物的降解

　　氯代芳香化合物从结构上说是指芳香烃及其衍生物中一个或几个氢原子被氯原子取代后的产物，氯原子的引入引起芳烃本身结构改变，造成氯代芳香化合物的生物降解性比芳烃类化合物要低很多。下面介绍氯苯、多氯联苯等几类物质的降解。

　　氯苯是化学性质较为稳定的一类化合物。因为氯原子有较高的电负性，强烈吸引苯环上的电子，使苯环成为一个疏电子环，导致很难发生亲电反应。与碳氢化合物相比，由于氯原子的引入其生物降解性大大降低，因此生物处理很难降解氯苯类化合物。但是有些微生物通过自然变种，或通过形成诱导酶，能够将氯苯类化合物降解或部分转化。氯苯类化合物降解的关键在于脱氯，根据脱氯过程中电子得失，将氯苯类化合物生物降解分为氧化脱氯和还原脱氯。

　　对于氯取代基在3个以下的氯苯，好氧条件下的降解基本上是先开环再脱氯。即在双加氧酶和去氢酶的作用下，将氯苯转化为相应的氯代邻二酚，再由可使苯环发生邻位裂解的酶催化氯代邻二酚邻位开环,生成相应的氯代粘康酸，此产物在内酯化过程中脱除氯原子并被氧化成氯代马来酰基乙酸，最终进入三羧酸循环。一氯苯的降解^[17]如图3所示。

　　图3  一氯苯的降解途径

　　在双加氧酶作用下发生双羟基化反应，生成3-氯邻二酚。此中间体邻位裂解后形成2-氯-2,4-二烯-己二酸(即2-氯-粘康酸)。脱氯过程发生在粘康酸内酯化形成4-羧甲烯基-2-丁烯-4-内脂的过程中。产物含有不饱和双键，可以被逐步还原，生成只含一个不饱和键的顺丁烯二酰基乙酸(即马来酰基乙酸)和碳链完全饱和的3-羰基-己二酸，最终进入三羧酸循环。二氯苯和三氯苯的降解，基本上与一氯苯类似，第一步也是双氧化作用生成二酚，氧化位点是连续两个没有氯取代基的碳原子，再经过开环被降解。但如果氯取代基达到4个或更多，则将进行先脱氯后开环再脱氯的催化反应，即在单加氧酶作用下，由羟基取代氯原子，再经过单加氧酶的进一步作用，形成开环裂解的中间体氯代邻二酚，才能进一步降解。

　　在氯苯的降解途径中，邻苯二酚是一种不稳定的中间物，因此由氯苯到氯代邻二酚是关键步骤，双加氧酶和去氢酶是关键酶，根据代谢工程原理，增加其编码基因的拷贝数，加快此一步骤，从而加速氯苯到中间产物的转化，提高降解速率。同时，增加裂解酶的活力，可消除邻二酚的积累，使得整个途径顺利进行。

　　氯苯的还原脱氯^[18]是指得到电子的同时去掉一个氯取代基，并释放出一个氯阴离子的过程。其厌氧生物降解机制主要是在酶催化作用下由氢取代氯，发生脱氯反应，使得氯取代基减少，再通过氧化脱氯途径降解。

　　另外，共代谢机制也是降解氯苯类化合物的一种手段。即选择易被微生物利用的、与目标降解物结构类似的生长基质，诱导微生物产生是目标降解物转变的酶^[19]，从而使得氯苯降解。

　　多氯联苯（PCBs）是一组有一个或多个氯原子取代联苯分子中的氢原子而形成的氯代芳香族化合物，有极强的稳定性，在自然界中很难被降解，但还是有一些微生物可以降解PCBs的。Seeger^[20]、Arsendorf^[21]、Abramowicz^[22]等研究认为，对于氯取代位点集中在一个苯环上的氯代联苯，一些细菌菌株，可通过在无氯取代苯环的2，3碳位上间位开环降解一氯、二氯、三氯及一些四氯联苯。降解途径是在2，3双加氧酶的作用下生成氯代苯甲酸和4-羟基戊酸，4-羟基戊酸可被降解菌株彻底矿化，氯代苯甲酸需被其他微生物进一步降解。一般而言，双加氧酶优先攻击无氯取代的苯环，但如果2，3碳位上无障碍，氧化反应也可以发生在有氯取代的环上^[23]。由于自然界中的PCBs降解菌株的修复效率比较低，所以有必要通过基因构建的方法获得高效的工程菌。Brenner等^[24]通过研究，确定了假单胞菌LB400中表达2，3-联苯双加氧酶（bphA），2，3-二氢双醇脱氢酶（bphB），2，3-二羟联苯1，2-双加氧酶（bphC）及2羟6氧6苯基2，4-二烯水解酶（bphD）的基因序列，并利用2，3-双加氧酶途径和宽宿主范围的质粒构建了重组菌株，4个PCBs降解酶基因的长度为12.4 kb，含有上述降解酶基因的大肠杆菌可以直接利用PCBs，而且不需要联苯诱导。

　　2-氯甲苯（2-chlorotoluene）也是一类较难降解的氯代芳香族化合物。Maria等^[25]对2-氯甲苯的代谢降解途径进行了深入的研究，并构建了可以降解2-氯甲苯的假单胞工程菌。组合的途径包括：一个编码甲苯双加氧酶基因（todC1C2BA）的片段，从菌株Pseudomonas putida F1的TOD系统获得，可以将2-氯甲苯转化为2-氯苯甲醛；另一个片段来自Pseudomonas putida mt-2菌株的PWW0质粒，编码整个TOL途径，表达的苯甲醇脱氢酶（由xylB编码）和苯甲醛脱氢酶（由xylC编码），可以将2-氯苯甲醇转化为2-氯苯甲酸。将上述的TOL和TOD片段组合到单个的mini-Tn5转座子，再将此转座子整合到2-氯苯甲酸降解菌Pseudomonas aeruginosa PA142和Pseudomonas aeruginosa JB2的染色体上，然后通过实验，证明的确可以将2-氯甲苯矿化，具体的降解途径是：2-氯甲苯转化为2-氯苯甲醇，再转化为2-氯苯甲醛，再转化为2-氯苯甲酸，PA142先将2-氯苯甲酸转化为邻苯二酚，再经由三羧酸循环而降解；而JB2则将2-氯苯甲酸转化为3-氯邻苯二酚，然后由三羧酸循环降解。但实验同时证明，PA142和JB2都不能将2-氯甲苯作为唯一的碳源。如图4所示。

　　图4  2-氯甲苯的降解途径

　　（图中：todC1C2BA为编码甲苯双加氧酶的基因；xylB为苯甲醇脱氢酶；xylC为苯甲醛脱氢酶；JB2和PA142为2-氯苯甲酸降解菌）

　　2.4  多环芳烃的降解

　　多环芳烃（PAHs）是指2个或2个以上的苯环稠合在一起的一类化合物，在环境中的性质稳定，具有强烈的毒性。PAHs不易被微生物降解，但不是不能降解。在微生物分泌的单加氧酶和双加氧酶催化作用下，把氧加入到苯环上，形成C-O键，再经过加氢、脱水等作用而使C-C键断裂，苯环数减少。其中真菌产生单加氧酶，加一个氧原子到苯环上，形成环氧化物，然后，加入H₂O产生反式二醇和酚。细菌产生双加氧酶，加两个氧原子到苯环上，形成过氧化物，氧化为顺式二醇，脱氢产生酚。最后，这些中间产物由微生物降解^[26]。

　　萘是最简单的多环芳烃，生物降解途径与其他芳香化合物基本相同，第一步是双加氧酶进攻苯环形成1，2 羟基萘，随后在第1和第9个碳原子间断裂开环，苯环数减少。其他多环芳烃的结构相对要复杂，降解也较难。Juhasz等^[27]研究了细菌和真菌降解苯并(ａ)芘的机理，结果显示，细菌双加氧酶从不同位点进攻苯并(ａ)芘,先是形成顺二氢二醇型中间产物,然后是一系列的酶促反应；真菌代谢苯并(ａ)芘最初的产物是反二氢二醇，代谢中起作用的都是P-450单加氧酶。根据代谢工程原理，可以通过分析细菌和真菌的代谢网络，确定双加氧酶和单加氧酶所对应的基因，并增加这些基因的拷贝数，强化苯并(ａ)芘到中间产物的转化。

　　3 讨  论

　　综上所述，各类芳香族化合物的生物降解途径基本上是一致的，先由双加氧酶或单加氧酶的作用，形成邻二酚类物质，然后在邻苯二酚2,3双加氧酶（C23 O）或1,2双加氧酶（CatA）的作用下，开环进入后续降解步骤。Eltis等的研究也证实了这一过程。因此，在实际的应用中，把上述几个酶的编码基因克隆并重组成一个质粒，导入已发现的假单胞菌等芳香族化合物的降解菌，将大大提高转化降解的速率。

　　根据代谢工程的基础理论，通过操作，原则上可以将所有的降解酶基因和质粒集合到某一菌株，人工制造出降解各类芳香族化合物的超级工程菌。但在实际的操作中，往往存在一些问题，无法达到预期的改造效果。

　　生物细胞经过人工的改造，引入外源基因或改变原有的代谢途径，理论上可以达到特定的目的，但细胞本身是一个整体，物质流的改变必然会影响到能量流，过量的某种基因的表达，可能导致细胞出现供能不足和内部生理功能的混乱，从而影响到对污染物的降解。对此，可以考虑利用共代谢降解，通过投加特定的基质，诱导产生新的降解酶，减少酶的表达数量，不致出现能量不足的情况。

　　由于质粒的遗传具有相对的独立性，引入微生物细胞的质粒，经过几代的培养，很可能丢失，导致工程菌失效；进入环境的质粒也可能污染其他的菌种，造成潜在的环境风险性。可以将目标基因直接整合到菌株的DNA上，增加遗传的稳定性。

　　另外，芳香族化合物的水溶性一般都比较差，因此在利用微生物降解时，由于不大容易进入细胞而使生物利用度较低，通过投加一定量的表面活性剂，可以促进芳香族化合物进入水相，从而更好地被降解。

　　随着人们对芳香族化合物污染的重视程度的提高以及科学研究的深入，芳香族化合物污染治理取得了一定的进展。生物修复技术是芳香族化合物污染环境治理最有前景的手段。对生物降解途径的研究，特别是基因序列研究的不断深入，应用代谢工程原理分析降解途径，并在此基础上构造高效的降解途径，构建高效的基因工程菌，同时寻找最佳的降解条件，促进大气、水体、土壤各环境体系中芳香族化合物污染的综合治理，最终控制和解决芳香族化合物环境污染问题。

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　　（收到修改稿日期：2005-11-14）

　　[1]第一作者：谢国建，男，1981年生，硕士研究生，主要研究方向为环境生物技术。#通讯联系人。